Cryo

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1775 (2023) Citer cet article

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Le complexe apical est une collection spécialisée de machines cytosquelettiques et sécrétoires chez les parasites apicomplexes, qui comprennent les agents pathogènes responsables du paludisme et de la toxoplasmose. Sa structure et son mécanisme de mouvement sont mal connus. Nous avons utilisé le fraisage cryo-FIB et la tomographie cryo-électronique pour visualiser la structure 3D du complexe apical dans ses états saillants et rétractés. Les moyennes des fibres conoïdes ont révélé leur polarité et leur disposition inhabituelle à neuf protofilaments avec des protéines associées reliant et stabilisant probablement les fibres. Ni la structure des fibres conoïdes ni l'architecture du complexe conoïde en forme de spirale ne changent pendant la protrusion ou la rétraction. Ainsi, le conoïde se déplace comme un corps rigide, et n'est pas semblable à un ressort et compressible, comme suggéré précédemment. Au lieu de cela, les anneaux apical-polaires (APR), auparavant considérés comme rigides, se dilatent pendant la protrusion conoïde. Nous avons identifié des filaments de type actine reliant le conoïde et l'APR lors de la protrusion, suggérant un rôle lors des mouvements du conoïde. De plus, nos données capturent les parasites dans l'acte de sécrétion lors de la protrusion conoïde.

Tous les agents pathogènes intracellulaires doivent accomplir l'entrée dans une nouvelle cellule hôte. Les parasites apicomplexes utilisent une machinerie d'invasion composée d'un complexe cytosquelettique spécialisé et d'organites sécrétoires. Collectivement, ce groupe d'organites est connu sous le nom de complexe apical. C'est pour cette structure que le phylum Apicomplexa est nommé, qui comprend les agents responsables du paludisme, de la toxoplasmose et de la cryptosporidiose. Les parasites apicomplexes appartiennent au super-phylum eucaryote Alveolata, comme les ciliés et les dinoflagellés (Fig. 1 supplémentaire). Le complexe apical est essentiel pour la motilité du parasite et pour l'invasion et la sortie des cellules hôtes. De plus, les mutations qui perturbent les fonctions complexes apicales bloquent le cycle lytique des apicomplexes, les rendant non infectieux1,2,3,4.

Le cytosquelette complexe apical lui-même est une structure d'environ 250 nm de long (~ 25% de la longueur d'un E. coli) composée d'une série d'anneaux organisés autour d'une spirale centrale de fibres de tubuline spécialisées appelées conoïdes, et à l'intérieur desquelles des organites sécrétoires sont organisés et préparés pour la sécrétion (Fig. 1a). Alors que les fibres conoïdes sont composées des mêmes dimères de tubuline qui composent les microtubules sous-pelliculaires des parasites, elles ne forment pas de tubes fermés5. Au lieu de cela, les fibres conoïdes forment une structure ouverte en forme de "C". Le complexe conoïde est très dynamique : il fait saillie et se rétracte6 lorsque les parasites sécrètent des adhésines et d'autres facteurs de motilité/invasion7,8. Remarquablement, le complexe apical semble avoir évolué à partir d'un cil eucaryote, car il contient à la fois de la tubuline et des protéines associées au cil9,10,11,12. De plus, le noyau du complexe apical, y compris le conoïde et ses structures de tubuline spécialisées, est conservé non seulement dans tout Apicomplexa13,14 et dans des organismes vivant en liberté étroitement apparentés15, mais également dans des Alveolata plus éloignés, tels que les dinoflagellés16,17 (Fig. 1 supplémentaire). Ainsi, le complexe apical semble être une structure ancienne, dont la composition moléculaire, la structure à haute résolution et la compréhension mécaniste de ses fonctions sont encore largement un mystère.

un aperçu de la bande dessinée des composants du complexe apical coccidien comparant les états saillants et rétractés. Ce schéma de coloration sera utilisé tout au long du manuscrit. b Une tranche tomographique à travers un conoïde partiellement rétracté qui a été cryo-FIB broyé en orientation transversale, montre clairement les SPMT se terminant près de l'anneau AAD et avec des projections AAD (flèches violettes) intercalées entre les SPMT voisins. c Coupe tomographique de l'extrémité apicale reconstruite de N. caninum avec conoïde en saillie. Notez la densité reliant les deux membranes du complexe membranaire interne (IMC, pointes de flèches cyan). Pour les autres étiquettes et colorations, voir ci-dessous. d Segmentation 3D et visualisation du complexe apical à partir d'un conoïde en saillie (tomographie différente de (c)). Étiquettes et couleurs utilisées dans tout le manuscrit, sauf indication contraire : AAD (violet), anneau de densité et projections amorphes associés à l'APR ; filaments de type actine (magenta en (c)); APR (rouge), anneaux polaires apicaux ; Fibre conoïde CF (orange), microtubules intraconoïdes ICMT (vert clair), complexe de membrane interne IMC (cyan), anneaux pré-conoïdes PCR (jaune), membrane plasmique PM (gris), microtubules sous-pelliculaires SPMT (vert foncé). e Coupe tomographique de l'extrémité apicale reconstruite d'un N. caninum fraisé avec un conoïde rétracté, annoté comme en (c). f Segmentation 3D et visualisation d'un conoïde rétracté (tomogramme différent de (e)) et coloré comme en (d). Dans les vues longitudinales, une pointe apicale est orientée vers le haut des images tout au long du manuscrit, sauf indication contraire. Barres d'échelle : 100 nm (en b–e).

Les caractéristiques ultrastructurales communes du super-phylum Alveolata comprennent les structures vésiculaires soutenues par le cytosquelette qui se trouvent juste à la base de la membrane plasmique et sont connues sous le nom d'alvéoles18. Chez les apicomplexes, ces structures sont appelées le complexe de la membrane interne (IMC), qui s'étend sur toute la longueur du parasite19,20,21,22. Les parasites apicomplexes ont deux ensembles distincts d'organites spécialisés, appelés les micronèmes et les rhoptries, à partir desquels les facteurs d'invasion et les protéines effectrices sont sécrétés (Fig. 1a)23,24,25. Alors que la sécrétion de rhoptrie nécessite un contact étroit avec la membrane plasmique de la cellule hôte, on pense que les micronèmes sécrètent en continu pendant que les parasites sont extracellulaires. Bien que ces organites sécrétoires ne soient pas largement conservés parmi les alvéolés, des travaux récents ont démontré que la sécrétion des rhoptries est médiée par un complexe qui est conservé à la fois dans sa structure et ses composants protéiques chez les ciliés tels que Tetrahymena et Paramecium26,27.

La cryo-tomographie cellulaire (cryo-ET) est une technique d'imagerie puissante qui peut révéler des détails structuraux avec une résolution moléculaire, mais l'épaisseur appropriée des échantillons biologiques est limitée à quelques centaines de nanomètres28. La plupart des cellules eucaryotes intactes sont plus épaisses que cela. Par conséquent, les précédentes études cryo-ET de cellules eucaryotes entières ont imagé soit des régions cellulaires naturellement minces, telles que les lamellipodes29 et les cils30, soit des cellules qui ont été comprimées en raison de l'incorporation dans une fine couche de glace (force de compression par la tension superficielle de l'eau)31,32. Des spécimens plus épais peuvent être rendus suffisamment minces pour la cryo-ET soit par sectionnement hydraté congelé à l'aide d'un couteau - qui est sujet à la coupe d'artefacts33 - soit par fraisage par faisceau d'ions cryofocalisé34.

Nous avons appliqué la cryo-ET aux parasites apicomplexes coccidiens Toxoplasma gondii, sans doute le parasite le plus répandu et le plus efficace au monde, et son proche parent Neospora caninum. Notre étude a principalement utilisé le broyage par faisceau d'ions cryo-focalisé (cryo-FIB) de cellules non perturbées noyées dans de la glace épaisse pour comparer le complexe apical coccidien dans ses états saillants et rétractés in situ, sans les artefacts de compression et de déformation qui ont tourmenté les études d'échantillons d'apicomplexes intacts non broyés31,32,35. Nos reconstructions tomographiques offrent une vue inégalée de la structure complexe apicale. La moyenne des fibres du conoïde par sous-tomographie a permis de démontrer clairement que, contrairement à une hypothèse populaire5,35, le conoïde n'est pas élastique et ne se déforme pas lors des cycles de protrusion et de rétraction. Nous avons également observé des filaments qui s'étendent entre le conoïde et les anneaux polaires apicaux (APR) à travers lesquels le conoïde se déplace, suggérant que la polymérisation de l'actine, ou d'une protéine semblable à l'actine, peut jouer un rôle lors du mouvement du conoïde. Nos données fournissent également une vue sans précédent des interactions entre les organites sécrétoires du parasite et le cytosquelette complexe apical. Enfin, nous avons pu capturer l'acte de fusion du micronème avec la membrane plasmique intacte. Ensemble, ces travaux fournissent des détails structurels et mécanistes pour la machinerie d'invasion apicomplexe, le complexe apical. Parce que ce complexe est essentiel pour l'infection par le parasite apicomplexan, la compréhension de la base moléculaire de sa fonction pourrait révéler de nouvelles cibles importantes pour une intervention thérapeutique pour certaines des maladies les plus dévastatrices au monde.

Le cytosquelette coccidien apparaît remarquablement bien conservé après extraction au détergent et coloration négative, ce qui a conduit à de nombreuses études TEM de l'ultrastructure apicomplexe en utilisant cette méthode de préparation1,4,5,36. Nous avons d'abord testé si la cryo-ET de cellules de Toxoplasma extraites au détergent puis congelées en plongée nous permettrait d'obtenir une vue 3D précise, avec une résolution améliorée des structures cytosquelettiques, par rapport à la TEM conventionnelle d'échantillons colorés en négatif (séchés). Bien que la cryo-ET des échantillons traités au détergent révèle des assemblages cytosquelettiques tels que le conoïde apical et les microtubules sous-pelliculaires à contraste élevé (Fig. 2 supplémentaire), les tomogrammes montrent également des artefacts de l'extraction du détergent ainsi que des distorsions structurelles (par exemple, aplatissement ; comparer la Fig. 2e – h supplémentaire) qui a compliqué l'obtention d'informations structurelles fiables à partir de ces échantillons.

Par conséquent, pour obtenir les échantillons les moins perturbés et de la plus haute qualité, nous plongeons les parasites intacts et vivants dans une couche de glace relativement épaisse (> 1 μm d'épaisseur; pour éviter l'aplatissement des cellules par la tension superficielle de l'eau). Nous avons ensuite utilisé le broyage cryo-FIB pour générer des lamelles de 150 à 200 nm d'épaisseur des parasites vitrifiés, mais autrement natifs (Fig. 3 supplémentaire). Pour générer ces échantillons, nous avons utilisé la souche NC1 de Neospora caninum, qui est un organisme BSL1 étroitement lié à l'agent pathogène humain Toxoplasma gondii (Fig. 1 supplémentaire). Le conoïde des parasites extracellulaires fait saillie et se rétracte en continu - avec et sans cellules hôtes présentes, mais juste avant la congélation en plongée, les parasites ont été soit préparés dans un tampon de type intracellulaire, soit incubés avec 10 μM d'ionophore de calcium pendant 10 min. de sorte que la majorité des parasites ont des conoïdes, de préférence dans les états rétractés ou saillants6, respectivement, sans bloquer la motilité des conoïdes ou les fonctions cellulaires comme la sécrétion. Les cryo-tomogrammes résultants révèlent des détails structurels bien conservés du complexe apical natif de N. caninum, y compris les membranes, les assemblages cytosquelettiques et les organites (Fig. 1 et Film supplémentaire 1).

Nous avons comparé l'architecture du complexe apical de N. caninum en deux états : conoïde en saillie et rétracté. À l'état protrudé (Fig. 1c, d et Film supplémentaire 1), les anneaux pré-conoïdaux (PCR) sont la structure cytosquelettique la plus proche de la membrane plasmique apicale (Fig. 1c, d), suivis du conoïde associé composé de 14 à 15 fibres conoïdes disposées en spirale (Fig. 2g, h supplémentaire). Par rapport à l'état conoïde en saillie, les fibres conoïdes à l'état rétracté sont repliées juste à la base des APR et les PCR sont situées légèrement au sommet des structures APR (Fig. 1e, f). De la base du conoïde en saillie, le complexe de la membrane interne (IMC) est clairement visible sous la forme d'une structure plate à double membrane avec des densités associées juste en dessous de la membrane plasmique du parasite (Fig. 1c, e). Notamment, notre cryo-ET in situ révèle plusieurs densités (non périodiques) qui relient les deux membranes de l'IMC étendu en forme de feuille (pointes de flèche cyan sur les figures 1c, 2c), servant peut-être d '«espaceurs» qui limitent la distance entre les membranes. Le bord apical de la feuille IMC est attaché aux anneaux polaires apicaux (APR; Fig. 1c – f). Juste en dessous de l'IMC, environ 22 microtubules sous-pelliculaires s'étendent à la base des APR (Fig. 1b – e). Bien que les microtubules sous-pelliculaires et les protéines internes des microtubules associées (MIP) soient bien résolues dans nos cryo-tomogrammes, nous ne nous y sommes pas concentrés ici, car ils ont déjà été analysés en détail35,38.

La microscopie optique à super résolution a suggéré que les composants de l'APR se séparent en anneaux indépendants39, mais ces anneaux ont été difficiles à résoudre avec une coloration négative EM. Dans nos tomographies, nous pouvons clairement résoudre plusieurs structures en forme d'anneau près du bord apical de l'IMC : deux APR distincts avec des diamètres similaires, c'est-à-dire l'anneau A1 (apical) et l'anneau A2 plus épais (basal) qui peuvent être constitués de deux sous-anneaux étroitement empilés A2a et A2b (Fig. 2a, b et Fig. 2d, 4a-c supplémentaires). Nous observons également un anneau de densité amorphe (nommé ici "densité associée à l'APR amorphe" ou AAD) situé entre l'IMC et les extrémités des microtubules sous-pelliculaires (flèches violettes / structure sur la Fig. 1b – f et Supplémentaire Figs. 2a, d, 4a – c). L'AAD semble être connecté aux anneaux APR et a des projections basales (21 nm de large et 64 nm de long) qui sont prises en sandwich entre des microtubules sous-pelliculaires adjacents (Fig. 1b). Les projections AAD n'ont pas été rapportées à partir d'études EM conventionnelles, mais ont récemment été observées dans une autre étude cryo-ET (appelée "piliers intercalés" dans la réf. 35). Nous observons les APR, l'anneau AAD et les projections AAD dans les tomogrammes des états conoïdes saillants et rétractés. Fait intéressant, l'anneau et les projections AAD semblent préservés lors de l'extraction au détergent du parasite (Figs. Supplémentaires 2a, d, 4a, b). Cette localisation et ce comportement biochimique suggèrent que l'anneau AAD et les projections peuvent contenir des composants de la calotte apicale IMC, qui ont récemment été localisés par microscopie optique à super-résolution comme imbriqués entre les microtubules4,40. Cependant, dans ces études, des protéines de coiffe apicale connues telles que ISP1 et AC9 s'étendent à environ 1 μm de l'APR, bien au-delà des ~ 64 nm occupés par les projections AAD. Par conséquent, l'anneau et les projections AAD semblent être composés de protéines qui n'ont pas encore été identifiées ou précisément localisées.

a Caricature du complexe apical à l'état protrudé, mettant en évidence les structures APR et IMC. b Une coupe tomographique (orientation longitudinale) montre deux anneaux APR distincts (têtes de flèche rouges) et l'anneau AAD (tête de flèche violette), qui est situé entre l'APR et l'IMC. c Une coupe tomographique en coupe montre l'IMC près du bord apical avec des densités "d'espacement" (pointes de flèche cyan) entre les deux membranes. d, e Tranches tomographiques à travers le complexe conoïde saillant de deux parasites. Les mesures marquent les distances minimales entre l'IMC et les fibres conoïdes de chaque côté du conoïde. f, g La tranche tomographique (f : originale ; f' : pseudo-colorée) et le rendu d'isosurface segmenté en 3D (g) de la même région à la base d'un conoïde en saillie montrent des densités filamenteuses de type actine (magenta) reliant le conoïde (orange) et les APR (rouge). Barres d'échelle : 100 nm (en b, d, e) ; 50 nm (en c, f).

Étonnamment, et contrairement à l'idée que l'APR sert à ancrer fortement le conoïde à la membrane du parasite, le conoïde en saillie n'apparaît jamais complètement carré aux APR dans nos tomogrammes (comparer en saillie sur les Fig. 1c, d, 2d, e à rétracté sur les Fig. 1e, f et les Fig. 4d – f supplémentaires). Au lieu de cela, le conoïde semble capable de s'incliner et d'être décentré par rapport à l'APR annulaire lorsqu'il fait saillie. Pour quantifier cette observation, nous avons comparé les distances entre le bord apical de l'IMC et le bord basal du conoïde des côtés opposés dans les tranches centrales à travers nos tomogrammes (Fig. 2d, e et Supplémentaire Fig. 4d – f). Nous avons constaté que la différence entre les distances opposées variait davantage dans les tomogrammes de l'état protrudé (Δd = 52 ± 12 nm ; n = 3) que dans l'état rétracté (Δd = 10 ± 4 nm ; n = 3). Ces données étaient cohérentes avec l'idée que le conoïde est "lié" aux APR et/ou au bord apical de l'IMC avec l'AAD par des structures flexibles et peut-être dynamiques. En effet, nous avons fréquemment observé des filaments entre la région APR et les fibres conoïdes (Figs. 1d, 2f, g et Fig. Supplémentaire 4g – l).

Des études antérieures ont montré que la "motilité de glissement" des apicomplexes est entraînée par le tapis roulant des fibres d'actine entre le cytosquelette IMC et la membrane plasmique du parasite. Récemment, des nanocorps d'actine F ont été utilisés pour démontrer que les fibres d'actine nucléent au niveau du conoïde et sont transmises au parasite lors de ses déplacements3. Nous observons clairement des filaments de diamètre cohérent avec des fibres d'actine (~ 8 nm de diamètre) s'étendant du conoïde pour se connecter à la région APR, près de l'endroit où le transfert vers le réseau de myosine associé à l'IMC devrait se produire. Ces filaments varient en longueur de 38 à 164 nm dans nos tomogrammes (n = 14 fibres de trois tomogrammes), ce qui suggère qu'ils sont de nature dynamique (Fig. 1d, 2f – g et Supplémentaire Fig. 4g – l).

Contrairement aux parasites intacts, dans nos échantillons extraits au détergent, la base conoïde semble reposer directement sur les APR (Fig. 2a, 4a, b supplémentaires), comme on le voit généralement dans des échantillons traités de manière similaire par une coloration négative EM4,5,36. Cet effondrement de l'écart et des structures filamenteuses suggère à tort que l'APR et ses connexions au conoïde sont beaucoup plus rigides que ce que nous observons dans nos échantillons cryo-FIB-moulus, mais autrement non perturbés, ce qui souligne à nouveau la valeur de notre analyse in situ des structures dans leurs états natifs.

Comme décrit ci-dessous, les fibres conoïdes sont des polymères de tubuline inhabituels dans lesquels les protofilaments forment une section ouverte en forme de C (film supplémentaire 1). Ces fibres ont été initialement décrites comme une plaie dans une structure "ressemblant à un ressort"5, conduisant à un modèle selon lequel les mouvements conoïdes étaient entraînés par un mécanisme semblable à un ressort, impliquant des cycles de déformation dans la structure conoïde suivis d'un relâchement. Cette hypothèse est rendue plus attrayante en raison de la forme inhabituelle en C des fibres conoïdes, qui devraient être plus déformables/compressibles que les microtubules fermés. Avant le développement du fraisage cryo-FIB, la microscopie électronique et l'analyse par tomographie du conoïde nécessitaient une extraction au détergent de la membrane parasitaire et / ou un aplatissement cellulaire, ce qui entraîne souvent des artefacts structurels lors de la préparation de l'échantillon et du traitement de l'image, où le biais d'orientation empêche une correction correcte du coin manquant (Fig. 2a – f, i supplémentaires). Nos données sur le complexe apical natif non perturbé nous permettent d'aborder sans ambiguïté les changements de l'ultrastructure conoïde au cours de différents états fonctionnels.

Nous avons donc cherché à évaluer si les mouvements des conoïdes se comportaient selon le modèle de type ressort impliquant la déformation des fibres conoïdes et conoïdes. Nous avons estimé que tout changement ultrastructural brut dans la conformation du polymère conoïde entraînerait des changements dans les dimensions globales et les architectures du conoïde. Nous avons comparé les dimensions des conoïdes saillants et rétractés dans les tomographies de N. caninum broyé par cryo-FIB (Fig. 3 et Fig. 5 supplémentaire). Ni les diamètres apicaux des conoïdes (244 ± 19 nm en saillie contre 236 ± 8 nm rétractés), les diamètres basaux (350 ± 25 nm contre 326 ± 7 nm), ni les hauteurs des conoïdes (277 ± 5 nm contre 262 ± 13 nm) étaient significativement différents entre les deux états (Fig. 3e et Fig. 5a supplémentaire). De même, l'angle des fibres conoïdes par rapport aux PCR et les intervalles entre les fibres conoïdes adjacentes étaient indiscernables dans les deux états (Fig. 3f – i). De plus, la longueur moyenne des fibres conoïdes et la distribution des longueurs dans la population n'étaient pas significativement différentes entre les états saillants et rétractés (399 ± 37 nm contre 405 ± 45 nm; Fig. 6a supplémentaire).

a–d' Des coupes tomographiques passant par le centre du complexe apical montrent le conoïde dans les états protrudé (a) et rétracté (b). Les lignes blanches indiquent les mesures du diamètre apical (a), du diamètre basal (b) et de la hauteur (h) de la structure conoïde. Les cases blanches en (a, b) indiquent les zones agrandies en (c, d) où le conoïde et le complexe associé à l'APR interagissent ; (c 'et d') sont les versions pseudo-colorées de (c et d), colorées comme détaillé sur la figure 1. Notez la densité allongée en forme de feuille (pointes de flèches dorées en a et b) entre les micronèmes et l'ICMT à l'intérieur du conoïde. Les densités "d'espaceur" IMC sont indiquées par des pointes de flèches cyan en (a, c). e Les mesures du diamètre apical, du diamètre basal et de la hauteur des conoïdes en saillie (n = 3 tomogrammes, barres blanches) et rétractées (n = 3 tomogrammes, barres grises) ne montrent aucun changement significatif au cours des cycles de protrusion et de rétraction. f – i Coupes tomographiques (f, g) à travers le bord des conoïdes reconstruits (montrant les fibres conoïdes dans la coupe longitudinale) dans les états protrudé (f) et rétracté (g). Les lignes indiquent la mesure de l'angle relatif entre les FC et le plan PCR (n = 14 mesures pour les états en saillie et 13 mesures pour les états rétractés, lignes rouges), et la mesure de la distance entre les FC voisins (n ​​= 24 mesures pour les états en saillie et 18 mesures pour les états rétractés, lignes bleues) ; les résultats de ces dernières mesures pour les conoïdes saillants et rétractés sont présentés en (h) et (i), respectivement. j – m Les tranches tomographiques montrent des PCR (j et m) et des APR (k et l) représentatifs dans des vues en coupe du complexe apical dans les états saillants (j, k) et rétractés (l, m). Les diamètres des APR et des PCR sont indiqués sous forme de plages à partir de tous les tomogrammes disponibles (n = 3 pour les APR dans les deux états ; n = 3 PCR en saillie ; n = 2 PCR rétractés). Barres d'échelle : 100 nm (en a, b, j–m) ; 50 nm (en c, d, f, g). Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type. La signification statistique a été calculée par un test t de Student bilatéral. ns non significatif (p > 0,05).

Alors que la pointe apicale du conoïde et les PCR sont au niveau de l'APR lorsque le conoïde est rétracté, après une extension du conoïde, la base du conoïde se situe dans la région de l'APR (comparer Fig. 3a, c, c' avec 3b, d, d'). En basculant entre les états protrudé et rétracté, les régions apicales IMC, l'AAD et les APR changent toutes de position par rapport au conoïde et à ses PCR associées, ainsi qu'à la membrane plasmique (Fig. 3a – d '). Les positions des APR et AAD semblent étroitement couplées au bord apical de l'IMC dans nos tomographies, qui semblent fléchir apicalement à l'état protrudé. Nous avons donc demandé si les APR présentaient des changements structurels corrélés à la protrusion et à la rétraction des conoïdes. Nous avons mesuré les diamètres des APR dans chacun de nos tomogrammes et déterminé qu'il y avait une augmentation frappante de 10 à 30 % du diamètre de l'APR dans les états saillants par rapport aux états rétractés (Fig. 3k, l et Supplémentaire Fig. 5b). Contrairement aux APR, la structure des PCR et du conoïde n'a montré aucune différence observable entre les deux états (Fig. 3j, m et Fig. 5c supplémentaire).

Nous avons ensuite évalué la structure des fibres conoïdes à une résolution plus élevée en générant des moyennes de sous-tomogrammes distinctes des fibres conoïdes à partir des états saillants (Fig. 4a; résolution d'environ 3, 0 nm à 0, 5 FSC, voir Fig. 6b supplémentaire) et rétractés (Fig. 4b; Résolution d'environ 3, 2 nm à 0, 5 FSC, voir Fig. 6b supplémentaire). Visuellement, les moyennes des sous-tomogrammes des fibres conoïdes de l'un ou l'autre état semblent largement indiscernables et révèlent les neuf protofilaments de tubuline5, ainsi que des densités de protéines distinctes décorant les fibres (Fig. 4a, b). Pour mieux évaluer toute variation entre les deux états, nous avons intégré des dimères de tubuline dans les deux cartes cryo-ET moyennes à l'aide de Chimera44 (Fig. 4c, d) avec des coefficients de corrélation d'environ 0,9. Nous avons ensuite superposé les modèles les mieux ajustés d'une seule répétition de la fibre conoïde de chaque état (Fig. 4e). Conformément à l'absence de différence entre la forme de l'ensemble de la structure conoïde entre les deux états (Fig. 3), chacune des neuf sous-unités de protofilaments apparaît positionnée de manière indiscernable entre les deux états dans la résolution des données et l'erreur de l'ajustement (Fig. 4e). Notez que les trois sous-unités de protofilament avec la RMSD la plus élevée dans leur superposition (PF5-7; Fig. 6c supplémentaire) sont ajustées dans une région de résolution inférieure des moyennes.

a, b Tranches tomographiques en coupe transversale des répétitions moyennes de 8 nm des fibres CF dans les états saillants (a) et rétractés (b). c – e La structure à haute résolution de la tubuline a été ajustée dans les moyennes des sous-tomogrammes des états saillants (c, bleu) et rétractés (d, rose). La comparaison (e) des deux modèles de protofilaments pseudo-atomiques dans les états saillants (bleu) et rétractés (rose) ne montre aucune différence significative. f Vues longitudinales du modèle de protofilament pseudo-atomique à l'état rétracté. Le pas a été estimé sur la base de la montée des MAP périodiques associés au CF entre les protofilaments voisins. g Le rendu isosurface des protofilaments moyennement pliés affiche une "inclinaison dans le sens des aiguilles d'une montre" lorsqu'ils sont vus de la base du conoïde, ce qui suggère que les extrémités négatives des fibres conoïdes sont orientées vers la base. h Les arrangements des protofilaments modélisés dans les FC (rose) par rapport à la structure cryo-EM haute résolution des microtubules sous-pelliculaires typiques à 13 protofilaments (vert ; EMDB : EMD-23870). La différence la plus importante est le changement d'angle entre PF4 et PF5, provoquant un pli serré dans l'arrangement des protofilaments. i–k Tranches tomographiques des moyennes globales du sous-tomogramme CF qui combinent toutes les données des états saillants (a) et rétractés (b) vus en coupe transversale (i : original ; i' : pseudo-coloré) et longitudinal (j et k) orientations. Les lignes blanches en (i) indiquent les emplacements des tranches dans les panneaux respectifs. Étiquettes et coloration voir ci-dessous. l–o Les rendus d'isosurface montrent les structures 3D des répétitions CF moyennes dans les vues en coupe transversale (l) et longitudinale (m), ainsi que les CF d'un conoïde complet (n) en assemblant les répétitions moyennes de 8 nm dans le tomogramme complet. Ceci et le zoom avant (o) montrent que la face ouverte des CF en forme de C fait face à l'intérieur du conoïde. Étiquettes et coloration : 1–9, protofilaments ; Densités IA (bleu) et OA (rose) "bras de couche interne" et "bras de couche externe", jonction interne IJ (jaune), MAP ; MAP1 (orange), MAP2 (magenta), MAP4 (vert), protéines associées aux microtubules. Barres d'échelle : 10 nm (en a, b, i–k).

Pris ensemble, nos données démontrent que le conoïde semble se déplacer comme un corps rigide pendant la protrusion et la rétraction, plutôt que comme une structure conformationnellement déformable, et il n'y a pas de réarrangement évident des protofilaments dans les fibres conoïdes au cours de ce processus. A partir de ces données, nous ne pouvons cependant pas exclure des changements conformationnels mineurs entre les deux états. Nos données in situ corroborent également le fait que les fibres conoïdes forment un arrangement inhabituel en forme de C ouvert de neuf protofilaments5 qui nécessite des contacts distincts d'un MT typique à 13 protofilaments (Fig. 4h).

Après avoir démontré que les fibres conoïdes ne subissent pas de changements conformationnels majeurs entre les états saillants et rétractés, nous avons combiné les particules des deux états pour calculer une moyenne globale des fibres conoïdes (Fig. 4i – k). La moyenne résultante des deux états montre un rapport signal sur bruit nettement amélioré et une résolution d'environ 2, 8 nm au critère FSC de 0, 5 (ou d'environ 2, 2 nm au critère FSC de 0, 143; Fig. 6b supplémentaire) et révèle la densité recouvrant à la fois les bords externes (protéines associées à MT; MAP) et internes (protéines internes MT; MIP) de la fibre conoïde (Fig. 4i – o et Film supplémentaire 1). Les densités MIP relient plusieurs protofilaments et recouvrent presque toute la surface interne de la fibre conoïde (Fig. 4i, i '). Ces contacts peuvent aider à expliquer la rigidité apparente de la structure des fibres conoïdes. La surface externe des fibres conoïdes apparaît également presque entièrement décorée de MAP (Fig. 4i – o et Supplémentaire Fig. 2i – k). Deux couches de MAP sont associées à PF5-8, appelées ici densités de «bras de couche interne» et de «bras de couche externe» (IA et OA; Fig. 4i, j et Supplémentaire Fig. 2i, j). Les MAP supplémentaires incluent MAP1, 2 et 4 qui sont associés respectivement à PF1, 2 et 4. Nous observons également des densités MAP de jonction interne (IJ) qui relient PF3 d'une fibre conoïde (n) à PF9 de la fibre voisine (n + 1; Fig. 4i, i ', k – o et figures supplémentaires. 2i, i ', k, 6f – h). Ces contacts inter-fibres stabilisent probablement la structure conoïde en spirale et renforcent sa rigidité. La plupart des MAP présentent une périodicité nette de 8 nm sur toute la longueur de la fibre conoïde (Fig. 4j, k, m et Fig. supplémentaires 2j, k, 6e, e ').

Les microtubules réguliers sont des assemblages hélicoïdaux qui ont une sensibilité, un pas hélicoïdal et une polarité caractéristiques. Par exemple, un microtubule typique à 13 protofilaments forme un polymère droit avec une montée de trois monomères (12 nm) par tour hélicoïdal gauche (une "hélice 13-3"), ou une montée de 0,92 nm par contact protofilament à protofilament45. En utilisant les MAP régulièrement espacées comme guide, nous avons pu attribuer le pas de la fibre conoïde dans les vues longitudinales (Fig. 4f, j, k et Figs supplémentaires. 2j, 6e, e '). Comme les fibres conoïdes en forme de C sont formées à partir d'un microtubule hélicoïdal ouvert plutôt que fermé, nous avons calculé uniquement le pas de protofilament à protofilament. Notre modèle indique que la fibre conoïde se forme à travers un assemblage gaucher - comme un microtubule typique, mais a un pas estimé d'environ 1, 5 nm de protofilament à protofilament, ce qui est environ 1, 6 fois plus grand qu'un microtubule typique (Fig. 4f et Supplémentaire Fig. 6e, e '). Pour déterminer la polarité structurelle de la fibre conoïde, nous avons effectué une moyenne d'un facteur neuf des protofilaments (en utilisant la tangentielle/normale à la courbure en forme de C de la fibre). Le rendu de l'isosurface des protofilaments moyennés par neuf affichait une "inclinaison dans le sens des aiguilles d'une montre" lorsqu'ils étaient vus de la base du conoïde, ce qui suggère que les extrémités négatives des fibres conoïdes sont situées à la base du complexe conoïde (Fig. 4g).

Au lieu des deux PCR précédemment signalées5,9, nous résolvons trois PCR (Fig. 5 et Fig. 2b, 7 supplémentaires): P1 est l'anneau le plus apical et le plus petit (Fig. 5b – d, g, h et Fig. 7e, i) avec un diamètre de 151 ± 6 nm - ce qui était probablement négligé dans les échantillons précédents traités au détergent et colorés négativement; P2 (milieu ; Fig. 5b–h et Supplémentaire Fig. 7f, j) se compose de deux sous-anneaux avec les diamètres suivants : P2a—178 ± 2 nm, P2b—217 ± 8 nm; et P3 (basal; Fig. 5c, d, g, h et Supplémentaire Fig. 7g, k) a un diamètre de 258 ± 8 nm (Fig. 5b – h). Tous les diamètres ont été mesurés sur les bords extérieurs des anneaux dans 4 cellules différentes (n = 4). La moyenne des sous-tomogrammes de la PCR à partir de quatre cellules de N. caninum reconstruites a produit une moyenne de résolution de 4, 9 nm (critère FSC de 0, 5, Fig. 6b supplémentaire) et a révélé à la fois la périodicité et les connexions entre les couches de PCR. Dans nos tomographies, chacune des couches semble avoir la même périodicité, avec 45 à 47 sous-unités par anneau (Fig. 5g, h). P2 et P3 sont connectés à des lieurs régulièrement espacés d'une longueur d'environ 25 nm, avec une densité de pont apparente entre les sous-unités de liaison voisines (Fig. 5b – d, g et Fig. 2b, 7c supplémentaires).

a Caricature du complexe apical mettant en évidence l'emplacement des PCR. b–d Tranches tomographiques (b et c) et rendu isosurface des répétitions PCR moyennes (d) vues dans les orientations tangentielle (b) et longitudinale (c et d), montrant différents composants de la PCR, y compris le P1 apical (mis en évidence par des pointes de flèches bleues), P2a (cyan), P2b (vert), P3 (jaune) et le lieur (orange) entre P2b et P3. La ligne blanche en (c) indique l'emplacement de la tranche en (b). e, f Des coupes transversales d'un tomogramme brut (e) et des répétitions PCR moyennes (f) montrent que l'anneau rond PCR P2 est composé d'un anneau externe et d'un anneau interne, P2a et P2b, respectivement. Le carré jaune en (e) indique l'orientation et l'emplacement de la moyenne du sous-tomogramme affiché en (f). g, h Les rendus d'isosurface montrent les PCR complètes en assemblant les répétitions moyennes au tomogramme complet. Barres d'échelle, 20 nm (en b, c, f) ; 50 nm (en e).

L'EM conventionnel des parasites apicomplexes fixés chimiquement et incorporés dans de la résine a fourni un aperçu de base de l'organisation des organites sécrétoires apicaux dans le conoïde coccidien5,46, que nous avons utilisé pour guider notre analyse de la structure in situ du complexe apical - y compris les organites sécrétoires - dans nos tomogrammes (Fig. 6, 7, Fig. 8 supplémentaire et Film supplémentaire 1). Nous observons clairement la paire centrale de microtubules intraconoïdaux (ICMT), s'étendant de la pointe du conoïde à la base sur 500 à 800 nm (Fig. 6a, b et Supplémentaire Fig. 6i), qui est plus longue que les 350 nm précédemment rapportés5. L'ICMT a été proposé comme un centre organisateur majeur de la sécrétion dans les coccidies47,48, et semble avoir un ensemble de protéines associées qui sont distinctes à la fois des microtubules sous-pelliculaires et des fibres conoïdes5, bien qu'une seule de ces protéines ait été identifiée à ce jour49.

a, b Les tranches tomographiques montrent l'extrémité apicale d'une cellule de N. caninum avec les organites sécrétoires organisés autour de l'ICMT (vert) à l'intérieur du complexe conoïde en saillie en vues longitudinales (a, a' - original en saillie et pseudo-coloré ; b - rétracté). Les longues ICMT relient l'apex du conoïde au cytosol et sont étroitement co-localisées avec les vésicules sécrétoires (bleu clair) et deux rhoptries (rose). Notez que la vésicule la plus apicale associée à la membrane n'est pas visible sur la coupe tomographique illustrée en (a), mais est visible sur les panneaux (c, d) et sur la figure 7b. Autre coloration : CF (orange), micronèmes (bleu foncé), densité en feuille (or), connexions inter-vésiculaires (rose), densité "couronnée" qui coiffe l'extrémité négative apicale de l'ICMT (violet). c – e Segmentation 3D et visualisation des tomogrammes montrés en (a et b, respectivement), c'est-à-dire avec conoïde en saillie (c, d) et rétracté (e), montrant l'organisation globale des organites sécrétoires dans le complexe conoïde, y compris les CF (coupés de l'avant pour montrer le contenu à l'intérieur), micronèmes, rhoptries, ICMT, vésicules, connexions inter-vésiculaires, structure en feuille le long des micronèmes et membrane plasmique (gris). d montre un zoom avant à partir de (c), avec des fibres conoïdes masquées pour plus de clarté. f, g Coupes transversales à travers les conoïdes saillants (f, f'—original et pseudo-coloré) et rétractés (g) des tomogrammes illustrés en (a et b). Barres d'échelle : 100 nm (en a, b) ; 50 nm (en f, g).

a–c' Les coupes tomographiques (a–c : originales ; a'–c' : pseudo-colorées) montrent : (a, a') cinq vésicules régulièrement espacées (bleu clair), dont quatre suivent l'un des microtubules de l'ICMT (vert clair) et sont reliées par des linkers inter-vésiculaires (rose) ; (b, b') une rhoptrie (rose) interagissant avec la membrane plasmique (PM) via la vésicule la plus apicale (bleu clair) et le complexe d'amarrage "rosette" (jaune) ; et (c, c') un échafaudage en spirale (rose foncé) associé à la membrane rhoptry dans la région rhoptry-cou. d, e Les tranches du sous-tomogramme représentaient en moyenne des répétitions de 8 nm des ICMT visualisées dans les orientations transversales (d) et longitudinales (e). f Occasionnellement, plus de deux microtubules ont été observés dans le complexe ICMT. Montré ici est un exemple de trois microtubules (pointes de flèches blanches). g ICMT moyenne par rotation de 13 fois à partir de 53 sous-tomogrammes de cellules de Toxoplasma extraites au détergent. Les flèches indiquent le biais dans le sens des aiguilles d'une montre des protofilaments lorsque les ICMT sont visualisés d'apical à basal, indiquant que les extrémités négatives des ICMT sont orientées apicalement dans le parasite. h, h ' Les extrémités basales des ICMT présentaient des extrémités évasées et différentes longueurs de protofilaments, ce qui est généralement associé aux extrémités positives dynamiques des MT. i Une coupe tomographique d'un conoïde en saillie montre l'organisation des micronèmes. Insertion : la moyenne du sous-tomogramme des pointes apicales de 25 micronèmes montre une coiffe aplatie et dense aux électrons. j, k Les tranches tomographiques fournissent une vue latérale (j) et une vue en coupe transversale supérieure (k) de deux organites sécrétoires, un micronème (M) et une vésicule associée à la rhoptrie (V), qui sont ancrées côte à côte à la membrane plasmique (la vésicule à travers la rosette (Ro)), mais avec des sites d'amarrage distincts (à 44 nm d'intervalle). Notez que les deux organites sont attachés (flèches roses et bleues) à la même crête ancrée à la membrane plasmique (flèches jaunes). La ligne blanche en (j) indique l'emplacement de la tranche en (k). Barres d'échelle : 100 nm (en I) ; 50 nm (en a–c, f, h, j, k) ; 20 nm (en insert i), 10 nm (en d, e, g).

Conformément à ce qui a été observé avec l'EM d'échantillons incrustés de résine5, nous observons que des organites sécrétoires distincts (les rhoptries et les micronèmes) se séparent sur les côtés opposés de l'ICMT dans les tomographies des conoïdes saillants et rétractés (Fig. 6). Nous avons également observé quatre à six vésicules régulièrement espacées suivant l'un des microtubules de l'ICMT (Figs. 6a – e, 7a, a '), conformément aux rapports précédents26,46. Nous avons observé une seule vésicule juste apicale de l'ICMT qui semble ancrée à la densité de la "rosette" récemment décrite (Fig. 7b-b '), et qui a été associée à la sécrétion de rhoptrie26. Conformément à cette fonction, nous observons que la vésicule amarrée à la membrane la plus apicale se connecte aux extrémités apicales d'une à deux rhoptries (Fig. 7b, b 'et Fig. 8a supplémentaire). Nous avons également identifié des densités claires reliant les vésicules à la fois à l'ICMT et entre elles au sein d'une chaîne (Figs. 6a – e, 7a). Notamment, nous n'avons pas observé cette densité de pontage au niveau de la vésicule apicale amarrée à la membrane (Fig. 7a ; n = 6 tomographies avec la chaîne de vésicules et la vésicule apicale présentes ; notez que dans d'autres tomographies, la vésicule apicale a été broyée par cryo-FIB). Alors que la vésicule apicale provient probablement de la chaîne de vésicules associée à l'ICMT, en s'arrimant à la rhoptrie et à la membrane plasmique, elle semble avoir été libérée de la chaîne de vésicules et de ses connexions. Nous avons également observé que certaines des vésicules apparaissent allongées le long de l'axe de l'ICMT, ce qui suggère qu'elles sont sous tension et ont été capturées dans un trafic actif le long de l'ICMT (Fig. 6a).

Une cellule parasite a environ 10 rhoptries et des dizaines de micronèmes, bien que seul un sous-ensemble de l'un ou l'autre des organites soit ancré au conoïde du parasite à un moment donné46. Dans tous les tomogrammes contenant le diamètre complet du conoïde parasite (6 tomogrammes sur 9), nous avons observé deux rhoptries suivant l'ICMT, mais sur les côtés opposés de l'ICMT (Fig. 6c – g; rose coloré). Cependant, nous n'observons pas de lieurs clairs reliant les rhoptries à l'ICMT. Dans la région apicale du parasite, un tire-bouchon de densité en forme de spirale le long des membranes de rhoptrie (Fig. 7b – c '), rappelle le schéma de localisation de Ferlin-2 vu par immuno-EM50. On avait précédemment estimé que les filaments en spirale le long des rhoptries à l'intérieur du conoïde avaient un diamètre d'environ 33 nm et un pas d'environ 21,5 nm à partir de tomogrammes d'échantillons non broyés dans lesquels les parasites avaient été aplatis en raison de la tension superficielle51. Nous avons constaté qu'une telle hélice prédite est cohérente avec nos mesures d'environ 36 nm de diamètre et d'environ 17 nm de pas provenant de parasites cryo-FIB broyés (Fig. 7c, c ').

En raison de leur courte longueur et de la variation potentielle de leurs protéines associées sur leur longueur, la moyenne des sous-tomogrammes de l'ICMT n'a pas donné une résolution suffisante pour résoudre clairement les MAP ou les MIP (Fig. 7d, e). Au lieu de cela, nous avons examiné la chiralité de la section transversale ICMT52 en utilisant une moyenne de sous-tomogramme ICMT à partir d'un tomogramme extrait par un détergent (Fig. 7g). Cette analyse démontre que les deux ICMT appariés, contrairement aux fibres conoïdes, ont leurs extrémités négatives orientées apicalement. De plus, l'extrémité basale plus de la paire ICMT présente la morphologie évasée typique d'un microtubule dynamique (Fig. 7h). Cette observation suggère que l'ICMT, contrairement à la plupart des autres structures MT apicomplexes, présente une instabilité dynamique à son extrémité positive (Fig. 7h) et peut expliquer pourquoi les longueurs ICMT précédemment rapportées varient largement entre les échantillons et sont systématiquement plus courtes dans les échantillons extraits5 par rapport à ceux que nous mesurons à partir de parasites indigènes intacts. Nous observons également une densité qui coiffe l'extrémité apicale négative de l'ICMT (Fig. 6a, b), ce qui serait cohérent avec un centre organisateur de microtubules à partir duquel les ICMT se polymérisent. Dans les coccidies, cependant, la γ-tubuline semble être limitée aux centrioles et au cytoplasme du parasite, et n'a pas été localisée au complexe apical53. Comme cela a été rapporté précédemment46, certains ICMT contenaient un troisième microtubule (Fig. 7f), ce qui suggère qu'un contrôle rigoureux de la structure n'est pas nécessaire pour sa fonction.

Notamment, l'ICMT et ses vésicules et rhoptries associées se séparent d'un côté du conoïde distinct de la région occupée par les micronèmes (Fig. 6c – g); ainsi, les ICMT ne sont pas directement impliqués dans l'organisation des micronèmes pour la sécrétion. Néanmoins, les micronèmes ne semblent pas désorganisés (Figs. 6c–e ; 7i). Au lieu de cela, ils sont disposés en grappes et montrent une orientation polarisée distincte. Les micronèmes sont relativement uniformes en longueur (220 ± 30 nm) et en largeur (58 ± 11 nm; Fig. 8b – h supplémentaire), et les extrémités basales sont arrondies, tandis que les extrémités apicales semblent étroites avec une calotte aplatie et dense aux électrons (Fig. 7i; encadré). Cette densité suggère un complexe d'échafaudage non décrit qui, selon nous, organise les micronèmes et aide à leur trafic. De plus, dans une tomographie d'un conoïde rétracté, nous avons observé deux micronèmes qui semblent être ancrés par leurs extrémités apicales à la membrane plasmique (Fig. 8i supplémentaire). De plus, nous avons systématiquement identifié une longue densité en forme de feuille entre les micronèmes et l'ICMT dans nos tomographies (Fig. 6a, b et Film supplémentaire 1). La feuille varie en épaisseur entre environ 4 et 8 nm, semble fibreuse, mesure environ 15 à 30 nm de large et peut souvent être tracée pour s'étendre du haut du conoïde jusqu'en dessous de sa base. Ces données suggèrent que la structure en forme de feuille peut aider à l'organisation et au trafic des organites sécrétoires.

Alors que les micronèmes sécrètent en continu pour favoriser la motilité des parasites extracellulaires, ils sont également intimement impliqués dans le déclenchement de l'invasion des cellules hôtes. Pour initier une invasion d'une cellule hôte, tous les parasites apicomplexes s'appuient sur la sécrétion d'un couple récepteur/co-récepteur comprenant une protéine micronème (AMA1) et une protéine rhoptrie (RON2)54,55. Il a été proposé de mélanger les composants micronème et rhoptrie de l'appareil d'invasion car ils étaient sécrétés par un chemin commun au niveau du conoïde23. Que nous observions des micronèmes séparés des rhoptries amarrées remet ce modèle en question. De plus, dans un tomogramme d'un conoïde en saillie, nous avons identifié un micronème qui semble avoir été capturé dans le processus d'amarrage/sécrétion de la membrane plasmique (Fig. 7j, k et Supplémentaire Fig. 8j – m). Conformément à un événement de sécrétion en cours, le micronème en question est environ la moitié de la longueur de tous les autres micronèmes mesurés (Fig. 8h supplémentaire, points de données rouges). Nous observons une densité cohérente avec un ou plusieurs sites de contact dans une région circulaire d'environ 85 nm de diamètre (Fig. 7k et Supplémentaire Fig. 8j, l). Nous observons également un bol apparent de densité à la surface de la membrane plasmique associée au site de contact (Fig. 7j et Supplémentaire Fig. 8j, m), compatible avec la sécrétion du contenu du micronème. Notamment, le site d'amarrage de ce micronème sécréteur est à 44 nm de la rosette et de sa rhoptrie amarrée / vésicule apicale, ce qui indique que les deux organites sécrètent sur des sites séparés à l'aide de mécanismes de sécrétion distincts (Fig. 7j). Cependant, la vésicule associée à la rhoptrie et le micronème amarré sont attachés à la même crête (Fig. 7j, k et Fig. 8j supplémentaire; flèches jaunes) et à l'ancre membranaire (Fig. 8m supplémentaire et encart; pointes de flèche jaunes), ce qui faciliterait probablement la coordination spatiale et temporelle de la sécrétion.

La structure conoïde du complexe apical a capturé l'imagination des microscopistes depuis ses premières descriptions par TEM conventionnelle56,57. Ici, nous avons appliqué la cryo-ET aux parasites broyés par cryo-FIB pour comparer les structures natives in situ du cytosquelette complexe apical coccidien et les organites sécrétoires associés dans les états saillants et rétractés du conoïde. Une saillie conoïde est associée à des changements morphologiques frappants à la pointe apicale du parasite qui sont visibles en microscopie optique6,58. Ces changements morphologiques, couplés à la forme en spirale inhabituelle du conoïde, ont conduit à un modèle selon lequel le conoïde ressemble à un ressort et se déforme lors de ses mouvements (protrusion/rétraction). La cryo-EM précédente de parasites extraits au détergent59 et une analyse cryo-ET récemment publiée35 documentent les différences entre les conoïdes saillants et rétractés. Cependant, la moyenne des sous-tomogrammes dans Sun et al. l'étude s'est concentrée sur des échantillons extraits de détergent, et les échantillons utilisés dans les deux analyses précédentes ont été compressés, ce qui peut entraîner des artefacts structurels.

En revanche, nos échantillons cryo-FIB-moulus préservent la circularité de la structure complexe apicale coccidienne (Fig. 2g, h et Film supplémentaire 1), ce qui permet une interrogation plus fiable de sa structure native. Nos données montrent que l'ultrastructure et l'organisation moléculaire des états saillants et rétractés du conoïde sont indiscernables, indiquant que les fibres conoïdes ne se déforment pas comme un ressort pendant les mouvements conoïdes, et ne fournissent donc pas d'énergie pour aider au mouvement conoïde ou à la sécrétion.

Alors que nous n'avons pas observé de changements dans la structure du conoïde rétracté par rapport à celui en saillie, nous avons constaté que l'APR semble se dilater pendant la protrusion, ce qui apparaît couplé à la flexion de l'IMC à la pointe apicale pendant la protrusion. Nous n'avons pas non plus observé de contacts étroits entre le conoïde et l'APR, plutôt le conoïde en saillie apparaît souvent quelque peu incliné par rapport au plan APR, compatible avec des attaches flexibles et/ou dynamiques reliant le conoïde à l'APR et/ou au bord apical de l'IMC. RNG2 semble être l'une de ces protéines, car ses extrémités N et C semblent s'étendre entre le conoïde et l'APR pendant la protrusion60. Alors que nous ne nous attendrions pas à identifier la densité d'une telle protéine intrinsèquement désordonnée, nous avons observé des densités qui s'étendent entre la base du conoïde en saillie et l'APR qui étaient compatibles avec les filaments d'actine/actine. Par conséquent, il est possible que la polymérisation de l'actine sur ce site soit au moins partiellement responsable de la génération de la force du mouvement conoïde. Notamment, une première description de la protrusion conoïde a révélé que la dépolymérisation de l'actine avec la cytochalasine D atténuait, mais n'a pas complètement abrogé, la protrusion conoïde6. Récemment, la Formine-1, qui est responsable de la polymérisation de l'actine au niveau du conoïde, s'est avérée essentielle pour la protrusion du conoïde61. Néanmoins, d'autres études structurelles à haute résolution utilisant des perturbations génétiques seront nécessaires pour placer des protéines individuelles dans le complexe apical et démêler la base physique de la dynamique et de la fonction des conoïdes.

Parce que nos échantillons cryo-FIB-broyés ont préservé les membranes du parasite, nous avons obtenu une vue inégalée des interactions entre le cytosquelette du complexe apical et les organites sécrétoires spécialisés du parasite. Nous avons observé des contacts étroits entre l'ICMT et les rhoptries du parasite et la chaîne de vésicules apicales. Ceci suggère que les ICMT sont responsables de l'organisation de ces organites, mais pas des micronèmes, avec lesquels nous n'avons observé aucun contact direct. Curieusement, alors que les ICMT ne sont pas largement conservés dans Apicomplexa en dehors d'Eucoccidiorida, une paire d'ICMT a été signalée dans Chromera velia15, un alvéolé vivant libre qui fait partie des organismes existants les plus étroitement liés à Apicomplexa (Fig. 1 supplémentaire). Ainsi, les ICMT étaient probablement présents dans les espèces ancestrales. Le fait que les vésicules apicales et les rhoptries suivent le long de l'ICMT suggère qu'un moteur de microtubules pourrait faciliter leur organisation, bien que les kinésines et les dynéines parasites n'aient pas été localisées dans l'ICMT. Étant donné que la majorité du trafic d'Apicomplexa semble se produire sur des filaments d'actine3, 62, 63, 64, les moteurs des microtubules du parasite n'ont pas encore été systématiquement caractérisés. Notamment, une seule protéine localisée ICMT a été identifiée à ce jour49, qui manque d'homologie claire avec les structures connues.

Une question ouverte majeure dans le domaine est la base moléculaire de la force qui entraîne la sécrétion des organites associés à l'invasion amarrés au complexe apical. Les rhoptries ont une longueur> 1 μm et nécessitent probablement une machinerie plus complexe qu'un simple amarrage à la membrane pour conduire la sécrétion. Curieusement, la dépolymérisation de l'actine à l'aide de la cytochalasine D bloque la motilité et l'invasion du parasite, mais pas l'attachement de la cellule hôte et la sécrétion de rhoptrie, ce qui suggère que l'actine n'est pas responsable de la sécrétion. Des travaux récents ont identifié les protéines apicomplexan Nd qui composent les "rosettes apicales", structures mieux caractérisées dans le groupe cilié d'Alveolata27. Semblable à leur rôle dans les ciliés, les protéines apicomplexes Nd sont essentielles pour la sécrétion de rhoptrie26, et la structure en rosette a été récemment décrite en utilisant la cryo-ET de parasites non broyés51. La protéine Toxoplasma Ferlin-2 est également requise pour la sécrétion des rhoptries50, et nous et d'autres51 avons identifié une densité en spirale autour des rhoptries dans le conoïde qui rappelle le schéma de coloration immuno-EM Ferlin-2 publié50. Ces filaments en spirale peuvent agir un peu comme de la dynamine pour comprimer les rhoptries pendant la sécrétion. Parmi les protéines associées à Toxoplasma Nd se trouvaient des protéines putatives liées à la GTPase26, suggérant qu'une activité de type dynamine pourrait également être présente sur ce site.

Avec la capacité de geler rapidement et ainsi de capturer des instantanés de processus cellulaires hautement dynamiques, nous avons pu observer un micronème ancré qui semble être en cours de sécrétion. Nous avons constaté que le site de sécrétion du micronème est distinct de celui d'une vésicule associée à la rhoptrie amarrée, ce qui suggère que les composants de la machinerie d'invasion sécrétés par ces deux organites doivent se retrouver dans la membrane plasmique apicale après la sécrétion. Nos données indiquent que la sécrétion de micronèmes peut se produire lors de la protrusion des conoïdes, événements indirectement corrélés par d'autres études7. Notez, cependant, que ces données n'excluent pas une sécrétion supplémentaire pendant l'état rétracté. Enfin, nous avons non seulement observé une crête et une ancre associées à la membrane plasmique entre le micronème amarré et la vésicule associée à la rhoptrie, mais également une feuille allongée (fibreuse) qui suit entre les micronèmes et l'ICMT. Ces structures peuvent représenter des éléments cytosquelettiques responsables de l'organisation, du trafic et de l'amarrage membranaire coordonné des organites sécrétoires apicaux. Le renouvellement des micronèmes nécessite un trafic le long de l'actine, bien que la biogenèse et l'organisation des micronèmes semblent indépendantes de l'actine63. D'autres études seront nécessaires pour identifier les composants moléculaires de l'ancre, de la crête et de la feuille, et leurs fonctions dans le trafic et la sécrétion des organites.

En résumé, cryo-ET de parasites cryo-FIB-broyés nous a permis d'examiner le complexe apical in situ, en surmontant les artefacts de compression qui se produisent lors de la préparation de cellules intactes dans une fine couche de glace. Ces avancées significatives nous ont permis d'interroger la structure native du complexe conoïde et ses mouvements lors de la rétraction et de la protrusion. Nous avons pu démontrer sans ambiguïté que le conoïde se déplace comme un corps rigide pendant la protrusion, avec des projections filamenteuses de type actine qui le relient à l'APR. La prochaine frontière dans la compréhension de la mécanique du complexe apical sera la capture des parasites lors de l'invasion des cellules hôtes. Il est possible que des composants du complexe apical subissent un certain changement de conformation lorsque le parasite est en contact intime avec une membrane de cellule hôte. Nous prévoyons également que d'autres études combinant des données protéomiques avec la cryo-ET de parasites broyés par cryo-FIB permettront le placement de protéines individuelles dans la structure complexe apicale, ce qui apportera un nouvel éclairage sur la base moléculaire et structurelle de ses mouvements et de sa fonction.

L'arbre phylogénétique de la Fig. 1 supplémentaire a été estimé dans RAxMLv8.266 en utilisant le modèle de substitution LG avec une hétérogénéité de taux gamma et des fréquences empiriques avec 1000 bootstrap en utilisant un alignement des séquences protéiques pour HSP90 concaténées avec RPS11 (accessions : AFC36923.1, BESB_021480, XP_029219085.1, LOC34617734, XP_ 022591029.1, ETH2_0701200, ETH2_0910900, NCLIV_040880, XP_003884203.1, TGME49_288380, XP_002366350.1, SN3_03000005, SN3_01300510, PBANKA_08057 00, XP_034421046.1, PF3D7_0708400, XP_001351246.1, PVP01_0108700, PVP01_0822500, GNI_014030, XP_011128490.1, KVP17_001483, KAH0483594.1, FG37 9_001268, KAH7649672.1, Chro.30427, OLQ16118.1, cgd3_3770, CPATCC_001922, Vbra_12473, CEM00719.1, Cvel_2184, Cvel_482, AAA30132.1, XP_764864.1, XP_95247 3.1, XP_952423.1, XP_001611554.1, XP_001609980.1, XP_002775585.1, XP_002766754.1, XP_001447795.1, XP_001445466.1, XP_001009780.1, XP_00103018 6.1, AAR27544.1, XP_009040431.1, XP_009033899.1).

Des fibroblastes de prépuce humain (HFF; un don de John Boothroyd) ont été cultivés dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de glutamine 2 mM. Les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (souche RH) et de Neospora caninum (souche NC1) ont été maintenus dans des monocouches confluentes de HFF. Les cellules de toxoplasme extraites au détergent et les moyennes de sous-tomographie associées sont affichées sur la figure 7g et les figures supplémentaires. 2a–f, i–k, 4a, b, 6i. Les reconstructions tomographiques de cellules de N. caninum broyées par cryo-FIB et les moyennes de sous-tomographie correspondantes et les analyses de données sont présentées sur les Fig. 1–6, 7a–f, h–k et Figs supplémentaires. 2g, h, 3, 4c – l, 5, 6a – h, 7, 8. Pour la préparation de parasites pour cryo-ET, des monocouches HFF hautement infectées ont été mécaniquement perturbées par passage à travers une aiguille de calibre 27 pour libérer les parasites. Pour les échantillons de "conoïdes rétractés", les parasites ont été conservés dans un "Endo Buffer" (K2SO4 44,7 mM, MgSO4 10 mM, saccharose 106 mM, glucose 5 mM, Tris-H2SO4 20 mM, BSA 3,5 mg/mL, pH à 8,2 avec H2SO4), qui préserve les parasites dans un état de type intracellulaire37. Pour les échantillons de "conoïdes saillants", les parasites ont été conservés dans une solution saline tamponnée HEPES pH 7,4 après libération des cellules. Tous les parasites ont été passés à travers un filtre de 5 μm pour éliminer les débris cellulaires, lavés dans un tampon approprié et collectés par centrifugation pendant 10 min à 300 × g. Les parasites ont été remis en suspension dans le tampon respectif et incubés pendant 10 min à 37 ° C avec un véhicule (rétracté) ou un ionophore de calcium 10 μM (en saillie; A23187; Cayman Chemicals). Environ 4 μl des parasites extracellulaires ont été pipetés sur une grille de carbone trouée en cuivre R2 / 2 à décharge luminescente (30 s à -30 mA) (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Allemagne). Les échantillons ont été rétrotransférés avec un papier filtre Whatman (grade 1) pendant 3 à 4 s pour éliminer l'excès de liquide, puis la grille a été rapidement plongée congelée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un congélateur à plongée fait maison. Pour les échantillons extraits au détergent, les membranes ont été extraites par l'ajout de Triton-X-100 dans du HBSS pendant 3 à 4 min avant de les laver brièvement dans du HBSS et de faire un back-blotting, comme ci-dessus. Les grilles vitrifiées ont été montées dans des autogrilles à encoches pour le broyage cryo-FIB (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) et stockées dans de l'azote liquide jusqu'à leur utilisation.

Des autogrilles avec des cellules vitrifiées de N. caninum ont été chargées dans une cryo-navette et transférées dans un instrument à double faisceau Aquilos (FIB/SEM ; Thermo Fisher Scientific) équipé d'une cryo-étage pré-refroidi à moins 185 °C. Des images en mosaïque de la grille ont été générées en mode SEM et les cellules adaptées au broyage cryo-FIB ont été ciblées à l'aide du logiciel Maps (Thermo Fisher Scientific). Pour protéger l'échantillon et améliorer la conductivité, la surface de l'échantillon a été recouverte de platine pendant 20 s à un courant de moins 30 mA, puis recouverte d'une couche de platine organométallique à l'aide du système d'injection de gaz préchauffé à 27 °C pendant 5 s à une distance de 1 mm avant le broyage67, 68. Le broyage en masse a été effectué avec un faisceau d'ions gallium de 30 kV de 50 pA perpendiculaire à la grille cellule. Ensuite, la platine a été inclinée à 10°-18° entre la grille EM et le faisceau d'ions gallium pour le broyage des lamelles. Pour le broyage grossier, la cellule a été broyée avec des faisceaux d'ions gallium de 30 kV d'un courant de 30 pA, suivis de 10 pA pour le polissage jusqu'à ce que la lamelle finale ait une épaisseur de 150 à 200 nm. Le processus de broyage a été surveillé par imagerie SEM à 3 keV et 25 pA. Un total de 178 lamelles de N. caninum ont été broyées au cours de plusieurs sessions.

Les lamelles broyées par Cryo-FIB des régions apicales vitrifiées des parasites ont été imagées à l'aide d'un microscope électronique à transmission Titan Krios de 300 keV (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un filtre d'énergie post-colonne Bioquantum (Gatan, Pleasanton, CA) utilisé en mode zéro perte avec une largeur de fente de 20 eV et une plaque de phase Volta avec une défocalisation de -0,5 μm69. Le logiciel de contrôle du microscope SerialEM v4.0.8 a été utilisé pour faire fonctionner le Krios et collecter des séries d'inclinaison de 56° à -56° par incréments de 2° en utilisant un schéma d'inclinaison dose-symétrique en mode dose perdue70,71. Les images ont été capturées à l'aide d'une caméra à détection directe d'électrons 5k × 6k K3 (Gatan) à un grossissement de 26 000x (taille de pixel de 3, 15 Å). Le mode de comptage de la caméra K3 a été utilisé, et pour chaque image inclinée, 15 images (temps d'exposition de 0,04 s par image, le débit de dose d'environ 28 e/pixel/s ; les images ont été enregistrées en mode super-rés puis regroupées par 2) ont été capturées. La dose totale d'électrons par série d'inclinaison était limitée à 100 e/Å2. Au total, 167 séries d'inclinaison ont été collectées à partir de la lamelle broyée par cryo-FIB de parasites indigènes, mais seulement environ 10% d'entre elles contenaient le complexe apical complet ou partiel. 19 séries d'inclinaison ont été enregistrées de la région apicale de parasites traités au détergent (non broyés par cryo-FIB).

Plusieurs facteurs contribuent au faible rendement du complexe apical dans nos expériences. Dans un premier temps, nous avons congelé en plongée les parasites intacts dans une couche de glace relativement épaisse (>1 μm). Il est difficile de déterminer les extrémités apicales vs basales des cellules intégrées à la glace dans l'instrument de fraisage cryo-FIB. Deuxièmement, lors de l'étape de broyage cryo-FIB, l'épaisseur de la glace a été réduite de plus de 1 μm à 150-200 nm, supprimant plus de 80 % du volume. Ainsi, la probabilité de placer la lamelle exactement dans la région du conoïde d'environ 300 nm de large est relativement faible par rapport au broyage accidentel du complexe apical lors de l'étape d'amincissement. Enfin, environ 10 à 15 % des lamelles ont été endommagées ou contaminées en surface lors de l'étape de transfert de l'instrument de fraisage au TEM. L'application future des systèmes de fraisage et d'autochargeur cryo-FIB guidés par fluorescence pour un transfert plus direct des échantillons broyés par FIB dans le TEM pourrait résoudre ces problèmes et augmenter le débit de l'expérience.

Les images de chaque image de série d'inclinaison ont été corrigées en mouvement à l'aide de MotionCor2 v1.2.3, puis fusionnées à l'aide du script extrait du progiciel IMOD v4.9.372 pour générer l'ensemble de données série d'inclinaison final. Les images de la série Tilt ont été alignées soit sans fiducial en utilisant le suivi des patchs (taille de 800 × 800 pixels), soit en utilisant des caractéristiques sombres comme fiducials (par exemple, des granules de la couche de pulvérisation ou du gallium intégré du processus de fraisage) à l'aide du progiciel IMOD. Les reconstructions tomographiques ont été calculées en utilisant à la fois la rétroprojection pondérée avant la moyenne du sous-tomogramme et la technique de reconstruction itérative simultanée pour visualiser les données brutes du tomogramme avec un contraste plus élevé, par exemple pour la sélection de particules. Sur les 167 séries d'inclinaison enregistrées de parasites indigènes broyés par cryo-FIB, 125 séries d'inclinaison ont été reconstruites pour une inspection plus approfondie, et 20 des tomogrammes reconstruits contenaient le complexe apical (13 en saillie et sept à l'état rétracté). Les sous-tomogrammes contenant la fibre conoïde, les répétitions ICMT ou PCR ont été extraits des tomogrammes bruts, alignés et moyennés avec une compensation de coin manquant à l'aide du programme PEET v1.10.073,74. Environ 1160 et 721 répétitions de fibres conoïdes de 8 nm ont été sélectionnées à partir des tomogrammes de conoïdes natifs saillants et rétractés, respectivement, et 386 répétitions ICMT de 8 nm ont été sélectionnées à partir des tomogrammes reconstruits d'échantillons extraits au détergent. Pour la moyenne PCR, 180 sous-tomogrammes de quatre tomogrammes (trois conoïdes saillants et un conoïde rétracté) ont été sélectionnés, et des listes de motifs initiaux avec des orientations de départ ont été générées à l'aide des fonctions spikeInit dans IMOD. Les corrélations de coquille de Fourier ont été calculées à l'aide de la fonction calcFSC et tracées à l'aide de la fonction plotFSC dans IMOD. Pour la pointe du micronème, 25 sous-tomogrammes de trois tomogrammes (deux saillants et un rétracté) ont été extraits, alignés et moyennés. Les paramètres concernant la collecte et le traitement des données sont résumés dans le tableau supplémentaire 1. Pour la visualisation des tranches tomographiques brutes, les tomogrammes ont été débruités pour une meilleure clarté en utilisant soit une diffusion anisotrope non linéaire, soit un filtre médian pondéré (filtre lisse) mis en œuvre dans IMOD. Les rendus d'isosurface et la segmentation cellulaire avec coloration manuelle ont été générés à l'aide du progiciel UCSF Chimera v1.10.275, qui a été développé par la Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de l'Université de Californie à San Francisco, avec le soutien du NIH P41-GM103311. Le film a été rendu dans Chimera et compressé avec ffmpeg v5.1.1.

Les rhoptries, les micronèmes et les vésicules peuvent être distingués en fonction de leurs morphologies distinctives. Les rhoptries ont une forme de club unique et pourraient être divisées en deux régions structurelles distinctes - un col tubulaire antérieur et un bulbe postérieur situé plus profondément dans le corps cellulaire. Les micronèmes sont des organites de taille moyenne, en forme de tige, et leur intérieur affichait une densité électronique plus sombre que les autres organites. Les vésicules étroitement associées à l'ICMT ou à la membrane plasmique apicale sont petites (diamètre <50 nm), rondes ou de forme ovale, et leur contenu apparaît plus brillant (propriétés de diffusion d'électrons inférieures) que le cytoplasme.

Afin de mesurer les dimensions des conoïdes, les tomogrammes ont été tournés dans les fenêtres de la trancheuse IMOD, avec le plan inférieur orienté horizontalement. La distance maximale dans la section longitudinale à travers le centre du conoïde a ensuite été utilisée pour déterminer les dimensions du conoïde, comme indiqué sur la Fig. 5a supplémentaire. Trois conoïdes saillants et trois rétractés ont été mesurés et comparés. Les longueurs des fibres conoïdes ont été mesurées comme suit : après que la fibre conoïde a été suivie manuellement à l'aide du programme IMOD, la longueur des fibres conoïdes et l'espacement entre les fibres conoïdes adjacentes ont été déterminées à l'aide des commandes IMOD imodinfo et mtk, respectivement. Au total, 20 fibres conoïdes pleine longueur des conoïdes saillants et 12 des conoïdes rétractés ont été mesurées. Pour comparer les APR et les PCR chez les parasites avec un conoïde en saillie ou rétracté, nous avons mesuré leurs diamètres comme suit : les tomogrammes ont été tournés dans la fenêtre de la trancheuse IMOD jusqu'à ce que des vues en coupe des PCR et des APR puissent être enregistrées (comme le montre la Fig. 5b, c supplémentaire) ; puis les diamètres des anneaux ont été déterminés à l'aide des outils de cercle ImageJ (Fiji distribution v1.53c). Des mesures ont été effectuées sur trois APR et trois PCR de conoïdes saillants, et trois APR et deux PCR de conoïdes rétractés. La distance entre le conoïde et l'IMC a été mesurée comme suit : nous avons positionné le centre de la vue dans la fenêtre de la trancheuse IMOD à l'extrémité apicale de l'IMC, puis avons fait pivoter le tomogramme autour de ce point central en 3D pour trouver la distance la plus courte entre le conoïde et l'extrémité apicale de l'IMC.

Nous avons résumé le nombre de tomographies représentatives pour chaque panneau de figures dans le tableau supplémentaire S2.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les cartes de densité moyenne du sous-tomogramme de la fibre conoïde de Neospora caninum dans les états saillants et rétractés, et une moyenne globale combinant les données des deux états ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) avec le code d'accession EMD-28247, EMD-28249 et EMD-26873, respectivement. Les cartes de densité moyenne des sous-tomogrammes des PCR P1-P2, P3 et la carte composite de P1-P2-P3 ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique (EMDB) avec le code d'accès EMD-28231, EMD-28234 et EMD-28246, respectivement. Toutes les autres données nécessaires pour évaluer les conclusions de l'article sont présentes dans l'article et/ou les documents supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Daniel Stoddard pour la formation et la gestion de l'installation de cryo-microscopie électronique à l'Université du Texas, Southwestern Medical Center, qui est soutenue en partie par le CPRIT Core Facility Support Award RP170644. Cette recherche a été soutenue en partie par les ressources informatiques fournies par l'installation de supercalcul BioHPC située dans le département de bioinformatique de Lyda Hill, UT Southwestern Medical Center.

Kai Cai

Adresse actuelle : Department of Biophysics, University of Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, États-Unis

Département de biologie cellulaire, Université du Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, États-Unis

Long Gui, Kai Cai, Evan Reetz et Daniela Nicastro

Département de pharmacologie, Université du Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, États-Unis

William J. O'Shaughnessy et Michael L. Reese

Département de biochimie, Université du Texas, Southwestern Medical Center, Dallas, TX, États-Unis

Michael L. Reese

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MLR et DN ont conçu le projet ; LG a effectué la reconstruction du tomogramme, la moyenne des sous-tomogrammes, l'analyse des données, la préparation des figures et des films ; WJO a réalisé la culture cellulaire, la préparation des échantillons et l'analyse des données ; KC a effectué la cryo-préparation, la collecte de données cryo-ET et le traitement initial de l'image ; ER a effectué un fraisage cryo-FIB ; MLR a effectué une analyse des données et rédigé le manuscrit avec l'aide de LG et DN ; DN a effectué l'analyse des données et supervisé l'ensemble du projet. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH ; R01GM083122 à DN et R01AI150715 à MLR), le Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT ; RR140082 à DN), la National Science Foundation (MCB1553334 à MLR) et la Welch Foundation (I-2075-20210327 à MLR).

Correspondance à Michael L. Reese ou Daniela Nicastro.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Naomi Morrissette et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Gui, L., O'Shaughnessy, WJ, Cai, K. et al. La cryo-tomographie révèle le mouvement des corps rigides et l'organisation de la machinerie d'invasion apicomplexe. Nat Commun 14, 1775 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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Reçu : 30 septembre 2022

Accepté : 10 mars 2023

Publié: 30 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37327-w

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